大家好！今天咱们来了解一项超有趣的生物材料研究——《Multifunctional Silk Vinyl Sulfone-Based Hydrogel Scaffolds for Dynamic Material-Cell Interactions》发表于《Biomaterials》。在生物科学领域，细胞和细胞外基质的互动就像一场神秘的“舞蹈”，影响着细胞的方方面面。以前的生物材料总有些不足，而现在，一种多功能丝乙烯基砜基水凝胶支架出现了！它就像一个万能“舞台”，能模拟细胞的生长环境，让我们更好地研究细胞行为。接下来，一起深入了解它的神奇之处吧！
*本文只做阅读笔记分享*
一、研究背景与意义
（一）细胞-ECM相互作用的关键作用
在生物体内，细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用犹如一场精妙的“对话”，对细胞的行为和命运起着决定性的影响。ECM就像一个动态变化的舞台，通过提供物理和化学信号来引导细胞的一举一动。在组织发育过程中，ECM为细胞提供了生长、分化和迁移的必要线索；而在疾病进展中，例如组织修复和纤维化阶段，ECM的变化更是与细胞的反应紧密相连。以组织修复为例，损伤会打破体内的稳态平衡，引发一系列复杂的动态细胞-ECM相互作用，如同一场精心编排的修复交响乐，旨在将组织恢复到健康状态。然而，在纤维化疾病中，这个修复过程却偏离了正轨，细胞-ECM相互作用陷入恶性循环，导致疾病逐渐恶化。因此，深入理解和模拟这些动态过程对于揭示生命奥秘、开发有效的疾病治疗策略具有举足轻重的意义。
（二）现有生物材料的不足与挑战
为了模拟ECM的微环境，科学家们已经开发出了各种各样的生物材料系统。这些材料试图通过调节生化组成、机械刚度和基质架构等因素来复制健康和患病组织的状态，为体外研究疾病进展和组织发育提供模型。然而，现有的生物材料往往只能聚焦于组织变量的某一个方面，如同盲人摸象，难以全面捕捉疾病进展或组织发育过程中复杂多变的动态特性。尽管部分材料在某些方面取得了一定的成果，但整体上仍然无法满足精确模拟体内真实环境的需求。例如，一些早期的材料在调节刺激响应方面存在局限性，无法提供足够的时空精度来准确反映体内细胞-ECM相互作用的微妙变化。这就促使我们寻找一种更理想的生物材料，能够更全面、精准地模拟细胞-ECM相互作用的动态过程。
（三）本研究的目标与创新点
本研究旨在引入先进的化学功能到丝蛋白中，从而开发出一种多功能的丝乙烯基砜基水凝胶支架（SilkVS）。我们希望通过这种创新材料，能够在体外更真实地模拟天然ECM的生化和机械特征，为细胞培养和疾病研究搭建一个更接近生理状态的平台。与以往的研究不同，我们将充分利用丝蛋白独特的化学性质、两亲性、自组装特性以及其形成高强度材料的能力。通过对丝蛋白进行化学修饰，使其具备酶促、点击和光化学等多种交联方式，从而实现对水凝胶支架机械和生化特性的精细调控。这种创新的设计理念有望填补现有生物材料的不足，为细胞-ECM相互作用研究带来新的突破。
二、SilkVS的合成与表征
（一）合成策略与原理
SilkVS的合成采用了一种巧妙的“一锅法”化学合成策略。在碱性水溶液条件下，我们将二乙烯基砜（DVS）作为关键的反应试剂，靶向丝蛋白中的丝氨酸和赖氨酸基团。通过精确调节DVS与丝氨酸的摩尔比（R值分别设定为1.25、2.5和5.0），我们能够有效地控制丝蛋白的功能化程度，就像调整一把精细的“化学开关”，决定了SilkVS最终的性能表现。
（二）表征手段与关键发现
1、结构确认的多维度证据
¹H-NMR谱图的揭示：通过¹H-NMR技术对合成产物进行分析，我们在δ=6.28ppm处观察到了一个明显的信号，这个信号就像是一个独特的“化学指纹”，确凿地证实了乙烯基基团已经成功地连接到了丝蛋白的主链上。这一发现为SilkVS的合成提供了最直接的证据，表明我们的合成反应按预期顺利进行，乙烯基砜基团已被精准地引入到了丝蛋白的结构之中。
FTIR光谱的深度剖析：FTIR光谱分析为我们提供了关于SilkVS结构的丰富信息。在1131cm⁻¹处出现的强烈吸收峰，对应着乙烯基砜亚砜（S=O）键的特征振动，这就像一个明确的“标签”，再次证明了乙烯基砜基团在丝蛋白结构中的存在。同时，在1600-1700cm⁻¹的酰胺I区域，我们观察到了与丝蛋白二级结构相关的吸收峰，其形状和位置与未修饰的丝蛋白相似。这表明在整个合成过程中，丝蛋白的二级结构并未因化学反应而发生显著改变，如同在精细的化学修饰过程中，丝蛋白的“骨架”依然保持完整。而且，随着R值的增加，我们可以清晰地看到乙烯基砜基团相对于酰胺I信号的丰度逐渐增加，这进一步验证了我们通过调节R值来控制功能化程度的策略是有效的，为SilkVS性能的可调控性提供了坚实的理论依据。
分子量测定的变化趋势：为了深入了解合成过程对丝蛋白分子量的影响，我们采用了凝胶电泳法（SDS-PAGE）对天然丝和SilkVS的分子量分布进行了详细分析。实验结果显示，随着R值的逐渐增加，由于乙烯基砜基团的不断添加，丝蛋白的总体平均分子量呈现出轻微的上升趋势。这一变化虽然相对较小，但却反映了合成反应对丝蛋白分子结构的微妙影响，进一步证实了我们所设计的合成方法能够在不严重破坏丝蛋白结构完整性的前提下，成功地引入乙烯基砜功能基团。
化学基团定量的反应验证：利用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBSA）测定法，我们对丝蛋白中赖氨酸的伯胺基团进行了定量分析。实验结果表明，随着反应的不断推进，伯胺含量随着R值的增加而逐渐降低。这是因为在合成反应过程中，赖氨酸的伯胺基团积极参与了与DVS的化学反应，从而被消耗掉一部分。这一结果从侧面进一步证实了我们所设计的合成反应确实如预期发生，并且有效地实现了对丝蛋白的化学修饰。
三、SilkVS水凝胶的形成与性能特点
（一）多样化的凝胶化机制
酶促交联的独特行为：SilkVS在辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H₂O₂）的共同作用下，能够发生酶促交联反应，进而形成水凝胶。这一过程与天然丝的交联机制有着一定的联系，但又存在明显的差异。
在SilkVS中，酪氨酸基序在形成二酪氨酸交联时的速率相较于天然丝明显降低，并且随着R值的不断增加，这种抑制作用变得愈发显著。这一现象就像是在原本顺畅的化学反应道路上设置了一道道“减速带”，导致反应速率逐渐放缓。我们推测，这可能是由于新引入的乙烯基砜基团改变了酪氨酸基序周围的化学环境，使得其在参与交联反应时受到了一定程度的阻碍，就像一个原本活跃的舞者被周围新的环境因素所干扰，无法像以前那样自由地舞动。然而，尽管存在这种抑制作用，SilkVS仍然能够在HRP和H₂O₂的催化下成功形成水凝胶，这表明其依然保留了一定的酶促交联能力，如同在困境中依然坚守着自己的“化学使命”。
点击化学交联的高效性：SilkVS主链上的乙烯基砜基团具有极高的化学反应活性，它能够与含巯基的分子（如1,4-二硫苏糖醇（DTT））发生迈克尔型加成反应，从而实现快速而高效的交联过程。在pH7.6的生理环境下，巯基被激活，仿佛从沉睡中苏醒过来，准备迎接一场“化学盛宴”。当我们向体系中添加交联剂DTT后，仅仅约15分钟，神奇的凝胶化现象就发生了。这就像一场迅速而有序的化学聚会，分子们在合适的条件下迅速结合在一起。而且，随着R值的增加，我们惊喜地发现凝胶化时间明显缩短，反应速率如同被注入了强大的动力，迅速加快。
通过与L-半胱氨酸反应来研究巯基-烯迈克尔型加成反应动力学，我们得到了类似的结果，反应速率随着R值的增加而呈现出明显的上升趋势。这表明，随着丝蛋白功能化程度的提高，点击化学交联的效率也在不断提升，如同一个随着训练而愈发强大的运动员，在化学的赛场上展现出卓越的表现。
光交联的快速响应特性：SilkVS中的乙烯基基团在光引发剂（如锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸酯（LAP））和蓝光（400nm）的协同作用下，能够发生自由基交联反应，实现水凝胶的快速形成。当蓝光照射到体系中时，就像一声“化学起跑令”，引发了一系列迅速的化学反应。我们可以观察到，剪切模量在光照后迅速增加，这表明水凝胶网络在瞬间开始形成并不断强化。而且，R值越大，模量增加的速率越快，这意味着功能化程度越高，SilkVS对光的响应就越迅速，光交联的效率也就越高。这种快速响应的特性使得SilkVS在某些需要精确时空控制的应用场景中具有巨大的潜力，例如在生物打印过程中，可以利用光交联的快速性和可控性来构建复杂的三维结构，就像一位技艺高超的建筑师，利用光作为“工具”，精准地构建出各种形状和结构的建筑。
（二）卓越的机械性能
压缩模量的变化规律：为了全面评估SilkVS水凝胶的机械性能，我们对不同交联方式形成的水凝胶进行了压缩模量测试。实验结果显示出了明显的规律：酶促交联的水凝胶压缩模量随着SilkVS功能化程度的增加而逐渐降低，这与我们在酶促交联过程中观察到的酪氨酸基序交联受抑制的现象相呼应，仿佛是因为交联过程受到了阻碍，导致水凝胶的结构变得相对疏松，从而无法承受更大的压力；而点击化学交联和光交联的水凝胶压缩模量则呈现出相反的趋势，随着功能化程度的提高而不断增加。这是因为在这两种交联方式中，乙烯基砜基团的存在增强了交联效果，使得水凝胶网络更加紧密和坚固，就像在建筑结构中添加了更多的“支撑梁”，使其能够承受更大的外力。
这些结果清楚地表明，不同的交联机制对水凝胶的机械性能有着截然不同的影响，而SilkVS的功能化程度则成为了调控水凝胶力学特性的关键“旋钮”，我们可以通过调整这个“旋钮”来获得满足不同需求的水凝胶材料。
弹性行为的良好表现：除了压缩模量，我们还通过流变学频率扫描和振幅扫描实验对水凝胶的弹性行为进行了深入研究。实验结果令人欣喜，所有的SilkVS水凝胶均表现出了良好的弹性行为。这意味着在一定的应变范围内，水凝胶的储能模量遵循牛顿行为，就像一个完美的“弹性弹簧”，其储能模量几乎不受施加应变的影响。这种良好的弹性回复能力使得SilkVS能够为细胞提供一个稳定而适宜的力学支撑环境，就像为细胞打造了一个舒适的“弹性摇篮”，模拟了天然组织的部分力学特性，有助于细胞在其中正常生长和发挥功能。
四、SilkVS在细胞培养中的应用与效果
（一）出色的细胞相容性
为了探究SilkVS作为细胞培养支架的可行性，我们将人正常肺成纤维细胞接种在SilkVS水凝胶上，然后采用Live/Dead染色和AlamarBlue代谢活性测定两种方法来综合评估细胞的生存状态和代谢活性。经过长达7天的观察和检测，我们得到了令人满意的结果：所有SilkVS材料组成均能够有力地支持细胞代谢活性的增加，就像为细胞提供了丰富的“营养土壤”，促进细胞茁壮成长。而且，在整个培养过程中，细胞死亡现象极少发生，Live/Dead染色结果显示，细胞呈现出强烈的绿色荧光（代表活细胞），而红色荧光（代表死细胞）则非常微弱。这充分证明了SilkVS具有出色的细胞相容性，为其在体外细胞培养领域的广泛应用奠定了坚实的基础。
（二）精准的细胞行为调控
细胞粘附的有效促进：我们巧妙地利用了SilkVS的乙烯基砜基团与含巯基的细胞结合肽CGRGDS（RGD-SH）之间的巯基-烯“点击”化学偶联反应，成功地将RGD-SH展示在水凝胶网络中，从而实现了对细胞粘附行为的精准调控。在无血清培养条件下，细胞在天然丝和SilkVS水凝胶上的粘附情况就像“无根之萍”，表现得非常微弱，因为天然丝本身缺乏有效的细胞结合位点，无法为细胞提供足够的“锚定点”。然而，当我们向体系中添加RGD-SH后，情况发生了戏剧性的变化，细胞粘附能力得到了显著增强，就像为细胞找到了可靠的“着陆点”。
通过对比实验发现，在SilkVS水凝胶上，细胞的粘附不仅数量明显增加，而且分布更加均匀，这表明RGD-SH与SilkVS之间的共价结合为细胞提供了更加稳定和有效的粘附界面。这一结果充分展示了我们通过生物偶联策略调控细胞行为的有效性，为细胞培养和组织工程应用提供了一种强有力的手段。在组织工程中，我们可以利用这种方法，根据不同组织的需求，精确地控制细胞在支架上的粘附位置和数量，从而构建出更加接近生理状态的组织模型，为组织修复和再生医学研究提供更有价值的工具。
细胞活化的精细调控：除了细胞粘附，我们还进一步探索了SilkVS对细胞活化的调控作用。我们将潜伏转化生长因子-β1（LTGF）通过巯基-烯化学共价结合到SilkVS基质上，然后观察成纤维细胞在这种修饰后的基质上的反应。实验结果显示，随着LTGF浓度的逐渐增加，成纤维细胞开始发生一系列显著的变化，其肌成纤维细胞活化程度不断提高，就像被逐渐唤醒的“沉睡细胞”。这种活化表现为α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达的明显增加，我们可以通过免疫荧光染色清晰地观察到αSMA的荧光强度随着LTGF浓度的升高而逐渐增强。当LTGF浓度超过10ng时，细胞活化程度达到了一个相对稳定的平台期，这表明细胞对LTGF的响应具有一定的饱和性，就像一个容器逐渐被填满，达到了它的容量极限。
这一结果深刻地表明SilkVS能够通过生物偶联策略精确地模拟ECM中的生化信号，从而实现对细胞行为的精细调控。在纤维化疾病研究中，这一特性为我们深入探究细胞活化机制提供了一个理想的模型，我们可以利用这个模型来筛选潜在的抗纤维化药物，或者研究纤维化疾病的发病机制，寻找新的治疗靶点。
（三）机械活化对细胞的深刻影响
硬基质模型的成功构建：为了模拟纤维化组织的力学特性，我们利用SilkVS的光交联特性，通过光诱导形成二级网络，成功地构建出了硬基质模型。对这些硬水凝胶进行压缩测试后，我们得到了令人振奋的结果：其压缩模量显著增加，这表明我们成功地将水凝胶的硬度提高到了与纤维化组织相似的水平。这个硬基质模型就像一个纤维化组织的“微型替身”，为我们研究细胞在纤维化环境中的行为变化提供了一个理想的平台。
细胞响应的显著变化：我们将成纤维细胞接种在软的未处理SilkVS基质和硬的光处理SilkVS基质上，然后观察细胞行为的变化。结果发现，在硬基质上，成纤维细胞就像受到了某种“刺激信号”的激发，表现出了更强的肌成纤维细胞活化现象，细胞铺展面积明显增加，αSMA表达也显著增多。这表明细胞能够敏锐地感知到基质硬度的变化，并做出相应的反应，就像一个敏锐的“环境探测器”，根据周围环境的变化调整自己的状态。
通过RT-qPCR分析，我们进一步证实了硬基质上的细胞中与纤维化相关的ACTA2和COL1A基因表达显著上调。这意味着细胞在硬基质上的活化不仅仅是表面现象，还涉及到基因表达水平的深刻变化。当我们在培养基中补充TGF-β1时，这种活化效应变得更加明显，就像给已经燃烧的火焰添加了“助燃剂”，进一步加剧了细胞的纤维化反应。这一结果突出了SilkVS在模拟疾病组织力学环境和研究细胞对机械信号响应方面的巨大潜力，为我们深入理解纤维化疾病的发病机制提供了重要的线索和依据。在未来的研究中，我们可以利用这个模型来探索如何干预细胞对机械信号的响应，从而为纤维化疾病的治疗提供新的思路和方法。
五、研究总结与展望
（一）研究成果总结
本研究成功开发了多功能的丝乙烯基砜基水凝胶支架（SilkVS），通过一系列实验验证了其在模拟细胞-ECM动态相互作用方面的卓越性能。在合成与表征方面，多种分析技术证实了SilkVS的成功合成及其结构和性能的可调控性。水凝胶形成机制的研究揭示了其独特的酶促、点击和光化学交联特性，以及不同交联方式对机械性能的影响。细胞培养实验全面展示了SilkVS良好的细胞相容性，以及通过生物偶联和机械活化调控细胞行为的能力，这对于深入理解细胞与ECM相互作用在组织发育和疾病进展中的作用机制具有重要意义。
（二）创新性与优势
本研究首次利用丝蛋白中相对丰富的丝氨酸基团引入乙烯基砜功能基团，实现了在不抑制丝蛋白酶促交联潜力的前提下，赋予其光交联和巯基-烯“点击”化学功能，这是对传统丝蛋白化学修饰方法的重要突破。
与其他类似生物材料（如聚乙二醇（PEG）或透明质酸（HA））相比，SilkVS具有显著优势。PEG或HA虽有类似化学功能，但往往需要多步合成且涉及苛刻处理过程，其生物相容性或机械完整性也存在局限性。而SilkVS基于天然丝蛋白，具有良好的生物相容性、优异的机械性能，且合成方法简便，为生物材料领域提供了一种更具潜力的选择。
（三）未来研究方向
在体外组织建模方面，SilkVS有望进一步优化，以更精确地模拟多种组织类型的复杂微环境。通过调整其生化和机械特性，可构建更真实的疾病模型，如模拟不同阶段的纤维化组织，从而为药物筛选和疾病机制研究提供更可靠的平台。
对于生物打印应用，SilkVS的光交联特性可被充分利用。未来研究可聚焦于提高其打印精度和分辨率，开发适用于SilkVS的生物打印墨水配方，以实现复杂三维组织结构的构建，如血管、器官等，为组织工程和再生医学领域带来新的发展机遇。
进一步探索SilkVS与其他生物活性分子或细胞的相互作用，拓展其在生物医学领域的应用范围。例如，研究其与免疫细胞的相互作用，为免疫治疗相关研究提供支持；或者探索其在神经组织工程中的应用潜力，促进神经细胞的生长和修复。
（四）研究意义与价值
本研究为生物材料领域提供了一种创新的多功能支架材料，丰富了体外细胞培养和组织工程研究的工具库。通过深入理解细胞-ECM相互作用，有助于推动基础生物学研究的进展，为疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。同时，SilkVS的开发也为丝蛋白基生物材料的进一步应用开辟了新的道路，有望在生物医学领域发挥更大的作用，对改善人类健康具有潜在的重要价值。
综上所述，本研究在多功能丝乙烯基砜基水凝胶支架的开发和应用方面取得了显著成果，为未来的生物医学研究和临床应用奠定了坚实的基础，具有广阔的发展前景和深远的意义。
六、一起来做做题吧
1、在SilkVS的合成过程中，通过什么手段确认乙烯基成功连接到蛋白质主链上？（）
A.傅里叶变换红外光谱（FTIR）
B.凝胶电泳法（SDS-PAGE）
C.核磁共振（NMR）
D.2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBSA）测定法
2、SilkVS发生酶促交联时，与天然丝相比其酪氨酸基序形成二酪氨酸交联的情况是（）
A.速率不变
B.速率增加
C.速率降低
D.无法形成交联
3、在细胞粘附调控实验中，添加什么物质后细胞在SilkVS水凝胶上的粘附明显改善？（）
A.辣根过氧化物酶（HRP）
B.1,4-二硫苏糖醇（DTT）
C.锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸酯（LAP）
D.细胞结合肽CGRGDS（RGD-SH）
4、与其他类似生物材料（如聚乙二醇（PEG）或透明质酸（HA））相比，SilkVS的优势不包括以下哪项？（）
A.合成方法简便
B.生物相容性更好
C.机械完整性更好
D.需要多步合成且处理过程苛刻
参考文献：
Falcucci T, et al. Multifunctional silk vinyl sulfone-based hydrogel scaffolds for dynamic material-cell interactions. Biomaterials. 2023 Sep; 300:122201.
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